髓核（NP）組織是一種凝膠狀組織，主要由II型膠原蛋白和蛋白聚糖組成。髓核細胞（NPC）負責合成細胞外基質(zhì)（ECM）成分（主要是II型膠原蛋白和聚集蛋白聚糖），在椎間盤（IVD）退變過程中首先表現(xiàn)出細胞凋亡和/或衰老樣變化。在椎間盤退變中，衰老的NP細胞積聚并導致增殖減弱，自我修復受損，細胞功能下降以及功能性ECM破壞加劇。因此，治療IVD退變的潛在策略是通過調(diào)節(jié)退變過程中涉及的潛在信號分子或通路來減輕或延緩NP細胞的凋亡和/或衰老樣變化。

通常認為，施加在IVD上的超負荷壓縮力是導致IVD退變的主要原因。既往研究表明，由于刺激蛋白聚糖合成，生理強度的壓縮負荷（0.35-0.75 MPa）可作為NP和AF（纖維環(huán)）細胞的合成代謝因子。相反，過度壓縮（≥ 1 MPa）加重了NP和AF細胞蛋白聚糖的分解代謝。盡管NP細胞壓縮負荷相關(guān)生物行為變化的分子機制尚不清楚，但大多數(shù)研究指出，超負荷壓縮誘導的NP細胞凋亡和衰老變化與機械敏感因子（如整合素和鈣粘蛋白）觸發(fā)的細胞內(nèi)氧化損傷有關(guān)。因此，探索NP細胞壓縮相關(guān)生物學變化中潛在的生物調(diào)節(jié)因子和信號通路具有重要意義。

在重慶醫(yī)科大學附屬第三醫(yī)院骨科及附屬第一醫(yī)院泌尿外科、九龍坡區(qū)第一人民醫(yī)院消化內(nèi)科的一項聯(lián)合研究中，以人NP細胞作為研究對象，利用自主研發(fā)的壓縮負荷生物反應(yīng)器，分析了NP細胞的凋亡和衰老樣變化；并進一步使用基于串聯(lián)質(zhì)量標簽（TMT-）的定量蛋白質(zhì)組學分析了在非壓縮，低壓縮力（LC）和高壓縮力（HC）負荷培養(yǎng)下的不同NP細胞之間的差異表達蛋白（DEPs），其中巨噬細胞移動抑制因子（MIF）和氧化應(yīng)激相關(guān)通路在體內(nèi)和體外進一步評估；還建立了MIF敲除（MIF-KO）NP細胞，以進一步確定MIF在經(jīng)歷超負荷壓縮的NP細胞中的保護功能。相關(guān)內(nèi)容發(fā)表在 Oxidative Medicine and Cellular Longevity 期刊題為“Deficiency of MIF Accentuates Overloaded Compression-Induced Nucleus Pulposus Cell Oxidative Damage via Depressing Mitophagy”。

該團隊之前的研究證實，機械壓縮誘導的水凝膠變形可以有效地模擬NP細胞或間充質(zhì)干細胞（MSC）的體內(nèi)負荷情況。因此，此次研究培養(yǎng)了NP細胞包裹的GelMA水凝膠，并使用自主開發(fā)的壓縮負荷生物反應(yīng)器提供間歇壓縮負荷，以0%、5%、10% 和20% 的壓縮變形施加仿生壓縮力（1.0 Hz，4小時/天），處理樣本分三組：對照組-0%、LC負荷組-5%變形、HC負荷組-20%變形。

首先，研究了梯度機械壓縮對人 NP 細胞的細胞衰老、活力和 ECM 合成的影響。結(jié)果顯示，HC組（變形≥10%）陽性細胞比例顯著增加，而LC組（變形≤5%）無明顯變化。熒光活/死染色結(jié)果也表明，超過10% 的壓縮變形顯著提高了NP細胞的死亡率，而LC組并無變化。檢測細胞凋亡率的結(jié)果表明，HC組NP細胞的凋亡明顯增強，LC組則無變化。此外，衰老相關(guān)標志物（P53、P21和P16）在遭受HC負荷的NP細胞中強烈過表達，而功能性ECM成分（聚集蛋白聚糖和II型膠原蛋白）的合成受到HC負荷的顯著抑制，但在LC組中沒有。

為了進一步分析壓縮相關(guān)的NP細胞存活和衰老過程中的潛在功能因素，采用基于TMT的蛋白質(zhì)組學分析，分別評估了對照組、LC負荷組和HC負荷組的DEPs （圖1）。根據(jù)三組對比結(jié)果，推測LC負荷組中過表達的蛋白與HC負荷組中低表達的蛋白的交集可能是NP細胞存活的保護因子。相反，LC負荷組中低表達的蛋白與HC負荷組中過表達的蛋白的交集可能是NP細胞存活的不利因素。因此，進一步分析了蛋白質(zhì)簇，并預(yù)測了NP細胞存活的8個潛在保護因子和3個潛在有害因子。在8個潛在的保護因子中，MIF 因其在調(diào)節(jié)椎間軟骨終板（CEP）細胞命運中的作用而被選中進行進一步的研究。此外，GO和KEGG富集分析表明，壓縮負荷通過調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)通路（ATP生物合成過程和氧化磷酸化）影響NP細胞的命運。

圖1 TMT定量蛋白質(zhì)組學程序的流程示意圖：NP細胞包裹的水凝膠在0%（對照）、5% 變形（低壓縮負荷）和20% 變形（高壓縮負荷）的動態(tài)壓縮下培養(yǎng)2周，蛋白質(zhì)提取物用10-plex TMT試劑標記，通過LC-MS/MS分析多肽。

接下來，為了進一步驗證MIF表達與壓縮負荷相關(guān)的NP退變之間的關(guān)系，實驗建立了大鼠尾部IVD超負荷壓縮模型（圖2 a）來檢測其對大鼠尾部NP組織生物學行為及MIF表達的影響。根據(jù)先前的研究，從遠端施加軸向力產(chǎn)生1.3 MPa的壓縮負荷，然后根據(jù)壓縮持續(xù)時間將大鼠分為三組：假手術(shù)組、2周負荷組、4周負荷組。壓縮大鼠尾部IVD的圖像表明，NP組織在2周的超負荷壓縮下出現(xiàn)退變跡象，在4周的超負荷壓縮下惡化（圖2 b、c）。此外，HE染色的形態(tài)學分析還顯示壓縮大鼠尾部IVD在2周和4周內(nèi)出現(xiàn)中度和重度退行性體征（NP丟失和AF纖維軟骨薄片波紋增加）（圖2 d、e）。阿利新藍染色結(jié)果還顯示，隨著IVD壓縮時間的延長，糖胺聚糖的含量逐漸下降（圖2 f、g）。值得注意的是，MIF表達在遭受2周壓縮的中度退行性NP中上調(diào)，但在遭受4周壓縮的嚴重退行性NP中下調(diào)（圖2 h、i）。

圖2 超負荷壓縮對大鼠尾部NP生物學行為及MIF表達的影響。

基于蛋白質(zhì)組學數(shù)據(jù)，通過分析氧化應(yīng)激相關(guān)生物標志物，進一步明確MIF相關(guān)NP退行性變化的分子機制。在分析氧化應(yīng)激相關(guān)生物標志物之前，敲除內(nèi)源性MIF（MIF-KO）不影響NP細胞的衰老速度，但HC負荷顯著加重了NP細胞的衰老，而MIF-KO進一步加劇了HC負荷誘導的NP細胞衰老。然后分析了NP細胞中細胞內(nèi)ROS含量，結(jié)果表明，單獨敲除MIF不會誘導ROS的積累。然而，HC負荷確實增加了NP細胞中ROS的含量，并且MIF-KO顯著增加了HC負荷處理的NP細胞中ROS的含量。此外，MIF-KO顯著消除了MIF的表達，但衰老相關(guān)標志物（P53、P21和P16）和氧化應(yīng)激相關(guān)標志物（NT）的表達不受MIF-KO的影響。與對照組相比，HC負荷降低了MIF的表達，顯著增強了P53、P21、P16和NT的表達。同樣，HC負荷處理的NP細胞中MIF的敲除進一步加劇了衰老相關(guān)和氧化應(yīng)激相關(guān)標志物的表達。這些數(shù)據(jù)表明，MIF的缺失加劇了遭受超負荷壓縮的人類NP細胞中氧化應(yīng)激誘導的衰老。

線粒體是細胞內(nèi)氧化磷酸化和形成ATP的主要場所，也是ROS的主要產(chǎn)生部位。之前的研究證實，線粒體自噬可以通過回收受損的線粒體來緩解氧化應(yīng)激誘導的NP細胞衰老。因此，實驗最后在當前研究的基礎(chǔ)上進一步觀察了線粒體自噬相關(guān)的標記。

蛋白質(zhì)印跡結(jié)果表明，MIF-KO和HC處理均能下調(diào)PINK1和LC3II/I的表達，上調(diào)Parkin 和P62的表達，這是線粒體自噬阻斷的標志（圖3 a、b）。值得注意的是，HC處理的NP細胞中MIF的敲除進一步加劇了線粒體自噬相關(guān)標志物的抑制（圖3 a、b）。JC-1染色結(jié)果表明，單獨敲除MIF不會引起線粒體損傷，但HC負荷加重了NP細胞線粒體損傷（圖3 c、d）。此外，HC處理的MIF-KO NP細胞具有最高的JC-1綠/紅色熒光比，表明MIF的缺失加劇了HC負荷誘導的受損線粒體的積累（圖3 c、d）。

為了進一步研究不同階段的線粒體自噬，用編碼GFP-LC3的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染NP細胞，分別標記自噬體和線粒體，觀察NP細胞中線粒體和自噬體的數(shù)量和形態(tài)。對照組和MIF-KO組NP細胞的線粒體保持正常的形態(tài)和結(jié)構(gòu)，而在HC負荷處理的NP細胞中，線粒體明顯萎縮，膜密度增加。此外，HC負荷的細胞在其細胞質(zhì)中表現(xiàn)出更多的自噬體，而用HC負荷的MIF-KO NP細胞在其細胞質(zhì)中沒有出現(xiàn)典型的自噬體。上述結(jié)果表明，MIF的缺失確實延緩了NP細胞的線粒體自噬，從而加劇了超負荷壓縮下氧化應(yīng)激誘導的NP細胞的衰老。

圖3 MIF-KO加劇氧化應(yīng)激誘導的NP細胞衰老和線粒體功能障礙。

圖4 MIF調(diào)控超負荷壓縮誘導的NP細胞衰老的潛在機制：超負荷壓縮誘導線粒體損傷，觸發(fā)NP細胞氧化應(yīng)激相關(guān)衰老。MIF的缺失抑制了NP細胞的線粒體自噬，這進一步加劇了超負荷壓縮力下NP細胞氧化應(yīng)激相關(guān)的衰老。

總之，該研究表明，超負荷的機械壓縮會導致人類NP細胞的氧化應(yīng)激、線粒體功能障礙和退行性變化。相反，適當?shù)纳韷嚎s力有利于維持NP的細胞活力和ECM穩(wěn)態(tài)。此外，MIF表達與NP細胞的機械壓縮力相關(guān)的生物學變化之間存在一定的關(guān)系。MIF的缺失加劇了超負荷機械壓縮下ROS的積累，線粒體功能障礙和衰老。該過程涉及的潛在分子機制與MIF的線粒體自噬誘導作用有關(guān)。該研究有助于我們更好地理解機械壓縮應(yīng)力在椎間盤退變過程中的調(diào)節(jié)作用，為使用MIF治療椎間盤退行性疾病提供了更有力的證據(jù)。

參考文獻：Wang Y, Hu Y, Wang H, Liu N, Luo L, Zhao C, Zhou D, Tong H, Li P, Zhou Q. Deficiency of MIF Accentuates Overloaded Compression-Induced Nucleus Pulposus Cell Oxidative Damage via Depressing Mitophagy. Oxid Med Cell Longev. 2021 Jul 1;2021:6192498. doi: 10.1155/2021/6192498. PMID: 34306312; PMCID: PMC8270705.
原文鏈接：https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/34306312

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